作业要求

需要用安装好的sratoolkit把sra文件转换为fastq格式的测序文件，并且用fastqc软件测试测序文件的质量！
作业，理解测序reads，GC含量，质量值，接头，index，fastqc的全部报告，搜索中文教程，并发在论坛上面。
来源于生信技能树：http://www.biotrainee.com/forum.php?mod=viewthread&tid=1750#lastpost

实验过程

1.fastq-dump将sra数据转换成fastq格式

# 需要将作业2（http://www.jianshu.com/p/da377252ee96）中下载的测序数据用工具sratoolkit转换成fastq的格式。
$ for ((i=56;i<=62;i++));do fastq-dump --gzip --split-3 -A ~/disk2/sra/SRR35899$i.sra -O ~/disk2/data/rna-seq;done

fastq-dump 用法：

–gzip 使得输出的结果是.gz 的格式
–split-3 对于PE测序，输出的结果是两个_1.fastq.gz
-A| –accession 输入你的sra文件可以是绝对路径，我的数据来源是~disk2/sra/SRR35899$i.sra （ 如果你直接写accession，那么fastq-dump 会默认重新下载数据，并且会放在~/ncbi/public/sra目录下）
-O 是设置输出的目录

fastq格式：

Fastq格式是一种基于文本的存储生物序列和对应碱基（或氨基酸）质量的文件格式。最初由桑格研究所（Wellcome Trust Sanger Institute）开发出来，现已成为存储高通量测序数据的事实标准。

fastq数据格式

每条read由4行字符构成：

第一行：必须以@开头，后面跟着序列的唯一ID以及相关说明内容。

第二行：核酸序列，是有ATCGN字符组成。

第三行：“+”开头，内容和第一行@后面的一样。

第四行：每个测序碱基质量，是用ASCII码来表示的，与第二行的字符数一致。

碱基质量得分与错误率的换算关系：

Q = -10log10p（p表示测序的错误率，Q表示碱基质量分数）

ASCII值与碱基质量得分之间的关系：

Phred64 Q=ASCII转换后的数值-64

Phred33 Q=ASCII转换后的数值-33

如何判断是Phred64 还是 Phred33 ？
ASCII值小于等于58（相应的质量得分小于等于25）对应的字符只有在Phred+33的编码中被使用，所有Phred+64所使用的字符的ASCII值都大于等于59。在通常情况下，ASCII值大于等于74的字符只出现在Phred+64中。如果是最近两年的测序数据，一般都是Phred33形式的。参考文章：http://blog.csdn.net/huyongfeijoe/article/details/51613827

2.Fastqc 进行测序结果的质控

用法：
fastqc [-o output dir] [–(no)extract] [-f fastq|bam|sam] [-c contaminant file] seqfile1 .. seqfileN
参数：
-o 输出目录，需自己创建目录
–(no)extract 是否解压输出文件，默认是自动解压缩zip文件。加上–noextract不解压文件。
-f 指定输入文件的类型，支持fastq|bam|sam三种格式的文件，默认自动识别。
-t 同时处理的文件数目。
-c 是contaminant 文件，会从中搜索overpresent 序列。

$ mkdir -p ~/disk2/data/QC
$ cd ~/disk2/data/rna-seq
# 将所有的数据进行质控，得到zip的压缩文件和html文件
$ fastqc -o ~/disk2/data/QC *.fastq.gz

质控结果文件

3.质控结果查看

质控结果有14个html文件，你可以选择用浏览器打开查看最终的QC reports。

• 首先来大概看一下QC结果报告。

  QC可视化结果——双击html文件，在浏览器中直接打开

• 左边是目录概要，可以点击想要看的结果，右边会跳转到特定详细的可视化结果。绿色代表“通过”，黄色代表“警告”，红色代表“不通过，失败”。

  Summary

• Basic Statistics，基本的数据统计包括文件名，文件类型，编码形式，总的序列数，质量差的序列，序列平均长度，GC含量。

  基本数据统计

• Per base sequence quality，每个read各位置碱基的测序质量。横轴碱基的位置，纵轴是质量分数，Quality score=-10log10p（p代表错误率），所以当质量分数为40的时候，p就是0.0001，质量算高了。红色线代表中位数，蓝色代表平均数，黄色是25%-75%区间，触须是10%-90%区间（黄色和触须我不是特别明白）。若任一位置的下四分位数低于10或者中位数低于25，出现“警告”；若任一位置的下四分位数低于5或者中位数低于20，出现“失败，Fail”。
  各位置碱基质量

• Per tile sequence quality，检查reads中每一个碱基位置在不同的测序小孔之间的偏离度，蓝色代表偏离度小，质量好，越红代表偏离度越大，质量越差。

  偏离度

• Per sequence quality scores，reads质量的分布，当峰值小于27时，警告；当峰值小于20时，fail。我的报告峰值在38。
  reads质量分布
• Per base sequence content，对所有reads的每一个位置，统计ATCG四种碱基的分布，横轴为位置，纵轴为碱基含量，正常情况下每个位置每种碱基出现的概率是相近的，四条线应该平行且相近。当部分位置碱基的比例出现bias时，即四条线在某些位置纷乱交织，往往提示我们有overrepresented sequence的污染。本结果前10个位置，每种碱基频率有明显的差别，说明有污染。当任一位置的A/T比例与G/C比例相差超过10%，报”WARN”；当任一位置的A/T比例与G/C比例相差超过20%，报”FAIL”。
  碱基分布
• Per Sequence GC Content，统计reads的平均GC含量的分布。红线是实际情况，蓝线是理论分布（正态分布，均值不一定在50%，而是由平均GC含量推断的）。 曲线形状的偏差往往是由于文库的污染或是部分reads构成的子集有偏差（overrepresented reads）。形状接近正态但偏离理论分布的情况提示我们可能有系统偏差。偏离理论分布的reads超过15%时，报”WARN”；偏离理论分布的reads超过30%时，报”FAIL”。
  reads 平均GC含量分布
• Per base N content，当测序仪器不能辨别某条reads的某个位置到底是什么碱基时，就会产生“N”，统计N的比率。正常情况下，N值非常小。当任意位置的N的比例超过5%，报”WARN”；当任意位置的N的比例超过20%，报”FAIL”。
  各位置N的reads比率
• Sequence Length Distribution，reads长度分布，当reads长度不一致时报”WARN”；当有长度为0的read时报“FAIL”。
  reads 长度分布
• Sequence Duplication Levels，统计不同拷贝数的reads的频率。测序深度越高，越容易产生一定程度的duplication，这是正常的现象，但如果duplication的程度很高，就提示我们可能有bias的存在。横坐标是duplication的次数，纵坐标是duplicated reads的数目，以unique reads的总数作为100%。下图中，大于10个重复的reads占总序列的20%以上，其他依次类推。当非unique的reads占总数的比例大于20%时，报”WARN”；当非unique的reads占总数的比例大于50%时，报”FAIL“。
  统计不同拷贝数的reads的频率

• Overrepresented sequences，一条序列的重复数，因为一个转录组中有非常多的转录本，一条序列再怎么多也不太会占整个转录组的一小部分（比如1%），如果出现这种情况，不是这种转录本巨量表达，就是样品被污染。这个模块列出来大于全部转录组1%的reads序列，但是因为用的是前200,000条，所以其实参考意义不大，完全可以忽略。

  一条序列的重复数

• Adapter content，接头含量

  接头含量

• Kmer content

  Kmer含量

参考资料：https://www.plob.org/article/5987.html；http://blog.sina.com.cn/s/blog_1319a10ee0102vfbx.html。

4.质控结果批量查看神器——MultiQC

知乎青山屋主写的为知笔记介绍了multiQC软件–批量显示QC结果。

# 利用Anaconda来安装MultiQC非常方便，首先得安装Anaconda，用清华源下载，特别快，而官网实则难以接受。
# 清华源地址：https://mirrors.tuna.tsinghua.edu.cn/help/anaconda/
# 官网：https://www.continuum.io/downloads/
$ cd ~/src
$ wget  https://mirrors.tuna.tsinghua.edu.cn/anaconda/archive/
# 下载到的是shell脚本文件，直接运行，安装完成
$ bash Anaconda2-4.4.0-Linux-x86_64.sh
# 添加 Anaconda Python 免费仓库
$ conda config --add channels https://mirrors.tuna.tsinghua.edu.cn/anaconda/pkgs/free/
$ conda config --set show_channel_urls yes
# 然后直接安装MultiQC
$ conda install -c bioconda multiqc
# 测试
$ multiqc --help
# 进入存放QC结果的文件夹，并执行multiqc
$ cd ~/disk2/data/QC
# 扫描结果文件，忽略html文件
$ multiqc /data/*fastqc.zip --ignore *.html
# 最后会默认生成一个名为multiqc_report.html文件，用浏览器查看，具体看青山屋主的介绍。

参考资料：https://mirrors.tuna.tsinghua.edu.cn/help/anaconda/
https://www.continuum.io/downloads/
http://fbb84b26.wiz03.com/share/s/3XK4IC0cm4CL22pU-r1HPcQQ1iRTvV2GwkwL2AaxYi2fXHP7